طرق التشخيص الجيني
زراعة الأنسجة وتحليل الكروموسومات
تحتوي الخلايا الجسدية البشرية على 46 كروموسومًا تتكون من 23 زوجًا. الأزواج الـ 22، والتي تسمى بالصبغيات الجسدية، هي نفسها بين الذكور والإناث. ويشكل الزوج الوحيد المتبقي الكروموسومات الجنسية (الجينوسومات) ويوجد بشكل عام على شكل XX في الإناث وXY في الذكور. الكروموسومات هي الهياكل التي تحتوي على الشفرة الوراثية (الجينات) في نواة الخلايا.
يتم عزل الكروموسومات عندما تكون الخلايا النووية المنقسمة قابلة للحياة، ويتم تثبيطها في المرحلة الانقسامية بعد أن تتكاثر الخلايا في ظروف الاستنبات المناسبة. يمكن الإبلاغ عن تحليل النمط النووي بمجرد تلطيخ الكروموسومات المعزولة وفحصها بحثًا عن تغييرات في الخصائص العددية والهيكلية.
ترتبط الانحرافات الهيكلية والعددية في الكروموسومات بالعديد من المتلازمات والأمراض، ويتم ملاحظتها بشكل خاص عند الأفراد الذين لا يستطيعون الحيض، أو الحمل، أو التعرض للإجهاض التلقائي المتكرر أو لديهم تقارير الفحص البدني عن تشوهات الكروموسوم مثل متلازمة داون وفي المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بسرطان الدم. . يمكن أن يؤدي اكتساب أو فقدان كروموسوم كامل أو جزء منه إلى شذوذات صبغية عددية غير متوازنة بما في ذلك التخلف العقلي، وولادات الأطفال غير الطبيعية، والإجهاض التلقائي، ومشاكل الخصوبة. على العكس من ذلك، فإن الأفراد الذين يعانون من شذوذات صبغية هيكلية مثل الإزاحة أو الانقلاب قد لا يواجهون مشاكل صحية أو اختلافات في القدرة على التعلم بسبب غياب الفقد الوراثي وبالتالي يُعرفون بالحاملين. ومع ذلك، فإن الكروموسومات المنقولة إلى أطفال الأفراد الحاملين للمرض قد تحتوي على معلومات وراثية غير متوازنة مما قد يؤدي إلى ولادات غير طبيعية أو إجهاض تلقائي. لذلك، من المهم لهؤلاء الأفراد الحصول على التشخيص الوراثي عن طريق الطرق الوراثية الخلوية التي تدعم تحليل جميع الكروموسومات أو عن طريق علم الوراثة الخلوية الجزيئي (FISH إلخ) لتحليل شرائح كروموسومية محددة. تحليل الكروموسوم مطلوب بعد الاستشارة الوراثية للمرضى المعرضين لخطر الإصابة باضطراب وراثي أو في حالة وجود مرض وراثي عائلي معروف. يمثل الدم المحيطي أو نخاع العظم أو خزعة الجلد أو مادة الإجهاض عينات أنسجة مختلفة لاستخدامها في عزل الكروموسومات.
:تحليل النمط النووي
يتم إجراء تحليل النمط النووي بشكل متكرر على الخلايا المعزولة من الدم المحيطي للمرضى على الرغم من أن نوع عينات الأنسجة التي سيتم تحليلها قد يختلف اعتمادًا على نوع مرض الكروموسومات أو عمر المريض عند التشخيص. يجب على المرضى إعطاء موافقة مستنيرة قبل أخذ عينات الأنسجة الخاصة بهم ومعالجتها للتحليل. تتطلب كل عينة من الأنسجة ظروفًا مختلفة للتخزين والشحن إلى المختبر. ولذلك، تم وضع معايير محددة لقبول العينة ورفضها. قد يتغير وقت إعداد تقرير تشخيصي بعد تحليل الكروموسوم اعتمادًا على ظروف زراعة الأنسجة لعينات المرضى.
الكروموسومات غير مرئية بالعين المجردة ولا يمكن رؤيتها إلا تحت المجهر عندما يتم صبغها بعد عزلها عن الخلايا المتكاثرة في المزرعة. لديهم أشرطة أفقية ساطعة ومظلمة مختلفة يتم ترقيمها بدءًا من السنترومير (النقطة التي تلتقي فيها الأذرع القصيرة والطويلة للكروموسوم) باتجاه الطرف المقابل. يُطلق على هذا النوع من تحليل الكروموسوم أيضًا اسم تحليل النمط النووي. إذا كانت التغيرات في الكروموسومات كبيرة بما فيه الكفاية، فيمكن لتحليل النمط النووي اكتشاف انحرافات الكروموسومات (زيادة أو فقدان محتوى الكروموسومات) أو إعادة الترتيب.
قد يصبح من الصعب تفسير نتائج الاختبارات الوراثية الخلوية والجزيئية أو في بعض الحالات قد لا تعكس الوضع الحقيقي لدى المرضى. من الأسهل اكتشاف الشذوذات الصبغية الهيكلية العددية أو الكبيرة باستخدام هذه الطرق، لكن الانحرافات الهيكلية الصغيرة والفسيفساء قد تظل غير مكتشفة. تم تصميم هذه الاختبارات لعوامل الخطر المحددة، وبالتالي تعطي معلومات فقط عن المرض المعني. ولا يقدمون أي معلومات عن أمراض أخرى. علاوة على ذلك، يمكن رؤية أمراض أو تشوهات مختلفة ذات أصل وراثي أو أي أصل آخر حتى في الأفراد ذوي النمط النووي الطبيعي.
يتم استخدام ربط الكروموسوم للكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات بحجم 5-10 ميغابايت من خلال تحليل بنية الكروموسوم وعدده اعتمادًا على الاختلافات في نمط النطاقات. يعد التهجين الفلوري في الموقع (FISH) طريقة محددة وحساسة تكتشف توطين الجينات الموجودة على الكروموسومات. يمكن لهذه التقنية تحديد التشوهات الصبغية بمقدار 1-3 ميغابايت والتي لا يمكن رؤيتها بشكل طبيعي بواسطة المجهر الضوئي. ومن الممكن أيضًا تحليل الشذوذات العددية و/أو الهيكلية في نواة الخلايا دون عزل مسبق للكروموسومات. لذلك، يمكن استخدام FISH أثناء تشخيص الأمراض الوراثية قبل الزرع أو ما قبل الولادة أو ما بعد الولادة من خلال التحقيق في عمليات حذف الجينات والانتقال والتضخيم.
FISH هي إحدى طرق علم الوراثة الخلوية الجزيئية التي تستخدم عادة في التشخيص الوراثي الخلوي وتتضمن تحليل الكروموسومات والنواة المعزولة من الخلايا المستنبتة بعد التهجين باستخدام مجسات الحمض النووي الموسومة بأصباغ الفلورسنت. توفر هذه الطريقة فقط معلومات حول مناطق الكروموسوم التي تم التعرف عليها بواسطة مجسات الحمض النووي وبالتالي لا يمكنها تحديد التشوهات في مناطق أخرى من نفس الكروموسومات أو مختلفة.
:aCGH (صفيف التهجين الجينومي المقارن)
aCGH هي طريقة جديدة تسمح بالتحقيق التفصيلي (دقة 25 كيلو بايت) للجينوم. يقوم aCGH بالتحقيق في الحمض النووي من المرضى والأفراد الأصحاء ويقارن الاختلافات بين عينتين. بهذه الطريقة، يمكن تحديد اختلالات عدد النسخ (الكسب أو الخسارة) في الحمض النووي. تتيح هذه الطريقة تحليل إعادة الترتيب التأسيسي غير المتوازن في الجينوم وتحديد آثارها على الجينات. إن اختلالات عدد النسخ هي تغيرات صغيرة في الحمض النووي لا يمكن اكتشافها تحت المجهر، وبالتالي يطلق عليها اسم "التعديلات دون المجهرية". يمكن أن يكون لها تأثير على النمو والتطور وكذلك على التعبير الجيني الذي يساهم في تطور العديد من الأمراض لدى البالغين.
في هذا الصدد، يتم استخدام aCGH كاختبار تشخيصي روتيني في قسمنا لوصف الجين أو مناطق الجين المسؤولة عن مسببات المرض لدى المرضى الذين لديهم تشخيص ذي صلة والذين لا يمكن فحصهم بطرق تشخيصية أخرى.
: aCGH مبدأ عمل
تتكون المصفوفات الدقيقة من آلاف مجسات الحمض النووي المرتبطة بسطح زجاجي. في البداية، يتم هضم جزيء الحمض النووي من المريض إلى أجزاء صغيرة يتم تمييزها بواسطة صبغة الفلورسنت. يتم أيضًا استخدام الحمض النووي المأخوذ من الأفراد الذين ليس لديهم أي شذوذات معروفة باعتباره الحمض النووي المرجعي الذي يتم هضمه مرة أخرى إلى أجزاء صغيرة ولكن يتم تمييزه بصبغة فلورسنت مختلفة. يتم خلط عينات الحمض النووي المرجعية والمريض معًا وتطبيقها على نفس الشريحة. بهذه الطريقة، يُسمح لشظايا الحمض النووي بالتهجين مع تسلسلات المسبار التكميلية المرتبطة بالشريحة الزجاجية. يتم بعد ذلك مسح الشرائح الزجاجية بواسطة الماسح الضوئي ميكروأري الذي يقيس إشارات الفلورسنت المنبعثة من المريض وشظايا الحمض النووي المرجعية المهجنة إلى المجسات وبالتالي يكتشف الحذف أو الازدواجية في جينوم المريض
الاختبارات الجينية الجزيئية
الوراثة هي المعلومات التي تؤثر على خصائص النسل عند نقلها إلى الجيل التالي. السمة العالمية للكائنات
الحية هي تخزين واستخدام ونقل المعلومات الوراثية إلى الجيل التالي من أجل القيام بوظائفها في الحياة
الأحماض النووية، وهي اللبنات الأساسية للخلايا، هي المسؤولة عن القيام بهذه الوظائف
تتكون الأحماض النووية من وحدات متكررة من النيوكليوتيدات. يحتوي كل نيوكليوتيد على ثلاثة أجزاء: 1) قاعدة نيتروجينية حلقية غير متجانسة، 2) سكر خماسي الكربون (البنتوز) و3) مجموعة فوسفات. يوجد جزيئين من الحمض النووي في الخلية. ويسمى الحمض النووي مع سكر الريبوز حمض الريبونوكلييك (RNA) ويسمى الحمض النووي مع سكر ديوكسي ريبوز حمض ديوكسي ريبونوكلييك (DNA). بالإضافة إلى ذلك، تختلف جزيئات DNA وRNA أيضًا حسب نوع القاعدة النيتروجينية التي تحتوي عليها: الأدينين والجوانين والسيتوزين موجودون في كلا النوعين من الأحماض النووية ولكن الثايمين يظهر فقط في DNA واليوراسيل فقط في RNA. تقوم معظم الكائنات الحية، باستثناء بعض الفيروسات، بتخزين المعلومات الوراثية في جزيئات الحمض النووي الخاصة بها
إن التطورات العلمية منذ اكتشاف التركيب الجزيئي للحمض النووي من قبل واتسون وكريك في عام 1953 لم تظهر فقط كيفية تحقيق تدفق المعلومات الوراثية داخل الخلية ولكنها عززت أيضًا تطوير تقنيات البيولوجيا الجزيئية التي يمكن استخدامها في تشخيص الأمراض الوراثية. الأمراض
في السابق، كان تشخيص الأمراض الوراثية يقتصر على التقييم السريري والاختبارات البيوكيميائية المعتمدة على تحليل البروتين، وبالتالي لم يتم استخدام التشخيص الجيني على نطاق واسع لعدة سنوات. السبب الرئيسي لذلك هو ضرورة العثور على الأنسجة الصحيحة التي تعبر عن البروتين المطلوب للتحليل حيث أن التعبير عن البروتينات يمكن أن يختلف من نسيج إلى آخر أثناء التمايز الخلوي. حقيقة أن جزيء الحمض النووي موجود في جميع الخلايا المنواة والسهولة النسبية للحصول على الحمض النووي من الأنسجة مثل الدم المحيطي قد مكنت من استخدام العديد من الاختبارات التشخيصية التي تعتبر علامة فارقة في الطب الجزيئي وتشمل اختبارات "تنبؤية" (لإثبات إذا كان الفرد معرضًا لخطر الإصابة بمرض معين) بالإضافة إلى التشخيص "ما قبل الأعراض" (يوضح ما إذا كان المرض المسبب للجين (الجينات) المسؤول عن مرض وراثي عائلي موجود في الفرد)، والتشخيص "ما قبل الولادة" (قبل الولادة) وتشخيص "ما قبل الزرع" (يظهر استعداد الجنين للإصابة بمرض وراثي قبل نقله إلى رحم الأم)
علاوة على ذلك، ومع التطورات الأخيرة في المعرفة العلمية والتكنولوجيا، أصبح من الممكن الآن تحليل عينات الحمض النووي الريبي (RNA) لتشخيص ومتابعة أمراض معينة. تعتبر الاختبارات التشخيصية المعتمدة على الأحماض النووية (DNA وRNA)، والتي أصبحت أيضًا تطبيقات مستخدمة على نطاق واسع في الطب، طرقًا حساسة للغاية وتوفر إرشادات مهمة في التشخيص والتشخيص وتخطيط أنظمة العلاج النسبية للعديد من الأمراض
الاختبارات قيد الاستخدام
:اختبار تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (QF-PCR)
يستخدم QF-PCR في الكشف عن شذوذات الكروموسومات قبل الولادة. يحتوي السائل الأمنيوسي الذي يت الحصول عليه أثناء بزل السلى الذي يقوم به طبيب أمراض النساء على خلايا تتساقط من جلد الجنين والتي يمكن استخدامها كمصدر لعزل الحمض النووي. يتم تضخيم مناطق محددة في الكروموسومات المعزولة من هذا الحمض النووي بواسطة مواد كيميائية موسومة بالفلورسنت. يُستخدم تحليل الأجزاء للكشف عن الزيادة في أعداد الكروموسومات باستخدام علامات محددة للكروموسوم المستهدف.
:تعدد الأشكال لطول جزء تقييد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR-RFLP)
يتطلب تحليل البدائل الأساسية التي يمكن أن تؤدي إلى حدوث طفرات في الحمض النووي تضخيم جزيء الحمض النووي. من الممكن تضخيم مناطق محددة من الحمض النووي في أنبوب اختبار باستخدام المواد الكيميائية المناسبة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يمكن أن يؤدي وجود البدائل الأساسية إلى تغيير مواقع التعرف على إنزيمات التقييد في المنطقة المستهدفة. ولذلك، تتعرض منطقة PCR المضخمة من
الحمض النووي لتقييد هضم الإنزيم ويتم تحليل المظهر الجانبي الناتج للأجزاء المنتجة في هذا الاختبار
التهجين العكسي
يتيح التهجين العكسي فحص مناطق متعددة من جزيء الحمض النووي في وقت واحد. تتضمن هذه التقنية، والتي تُعرف أيضًا باسم PCR "Multiplex"، تضخيم عدة مناطق مستهدفة في نفس الوقت في تفاعل واحد باستخدام مواد كيميائية مناسبة. في الخطوة التالية، يتم استخدام شريط اختبار محدد يحتوي على آبار مملوءة بالمواد الكيميائية التي يمكنها التعرف على أجزاء الحمض النووي السليمة والمتحولة. يتم خلط منتجات PCR مع هذه المواد الكيميائية ويتم تحليل التفاعل الناتج في الآبار.
في الوقت الحقيقي PCR
يعتمد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي على التضخيم المتزامن للأحماض النووية واكتشاف الزيادة في إشارة الفلورسنت. وهي تقنية شائعة الاستخدام في تحليل الحمض النووي بالإضافة إلى دراسات التعبير الجيني
تسلسل الحمض النووي
يحدد تسلسل الحمض النووي تسلسل النيوكليوتيدات (الأدينين والجوانين والسيتوزين والثايمين) في جزيء الحمض النووي. في البداية، يتم تضخيم منطقة جزيء الحمض النووي المراد فحصها باستخدام مواد كيميائية محددة. تتم تنقية منتجات PCR هذه وتضخيمها مرة أخرى باستخدام مواد كيميائية موسومة بالفلورسنت هذه المرة. يتم فصل العينات عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري ويتم التقاط انبعاث الفلورسنت وتحليله على الكمبيوتر.
التفتيش والتحقق من هوية خطوط الخلايا
قد تصبح خطوط الخلايا المستخدمة في مختبرات الأبحاث ملوثة أو تفقد بعض خصائصها بعد التعرض لدورات المرور المتكررة. لهذا السبب، من المهم التحقق من هوية خطوط الخلايا عند وصولها لأول مرة إلى المختبر وأيضًا ما إذا كانت تظهر سلوكًا غير عادي أثناء زراعتها.
اختبار الميكوبلازما
تتداخل العدوى بالميكوبلازما مع معدل النمو واستقلاب الخلايا في المزرعة ويمكن أن تتسبب في تعرض الباحثين للعديد من المشكلات. ولذلك فمن الأهمية بمكان اختبار ثقافات خطوط الخلايا لعدوى الميكوبلازما عند وصول الخلايا لأول مرة إلى المختبر أو في حالة مواجهة أي مشاكل خلال ثقافتها.
تخليد الخلايا الليمفاوية
يمكن استخدام الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي كمصدر للخلايا للتحليل في الأبحاث والتطبيقات الروتينية. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة لمزيد من الدم من المرضى لعزل الخلايا الليمفاوية إذا كان هناك نقص في المواد البيولوجية مثل عينات الحمض النووي. يعد تخليد الخلايا الليمفاوية تطبيقًا مهمًا لتوفير استمرارية المواد البيولوجية في المواقف التي لا يكون فيها الوصول إلى المتبرع بالدم سهلاً أو ممكنًا.