Генетические диагностические методы
Культура тканей и анализ хромосом
Человеческие соматические клетки содержат 46 хромосом, образующих 23 пары. 22 пары, называемые аутосомами, одинаковы у мужчин и женщин. Оставшаяся пара составляет половые хромосомы (гоносомы) и обычно встречается как XX у женщин и XY у мужчин. Хромосомы — это структуры, содержащие генетический код (гены) в ядре клеток.
Хромосомы изолируются, когда жизнеспособные делящиеся клетки останавливаются на митотической стадии после размножения в подходящих условиях культуры. Кариотип анализируется после окрашивания изолированных хромосом и исследования их численных и структурных характеристик.
Структурные и численные аномалии хромосом связаны с различными синдромами и заболеваниями, особенно наблюдаются у людей, которые не могут менструировать, забеременеть, испытывают повторяющиеся спонтанные аборты или имеют результаты обследования с хромосомными аномалиями, такими как синдром Дауна, а также у пациентов с диагнозом лейкемия. Потеря или приобретение целой хромосомы или её сегмента может привести к несбалансированным численным хромосомным аномалиям, включая умственную отсталость, рождение аномальных детей, спонтанные аборты и проблемы с фертильностью.
Лица с структурными аномалиями хромосом, такими как транслокации или инверсии, могут не испытывать проблем со здоровьем или различий в обучении из-за отсутствия генетической потери и поэтому известны как носители. Однако хромосомы, переданные их детям, могут содержать несбалансированную генетическую информацию, что может привести к аномальным рождениям или спонтанным абортам.
Поэтому важно, чтобы такие лица проходили генетическую диагностику с использованием цитогенетических методов, поддерживающих анализ всех хромосом, или молекулярной цитогенетики (например, FISH) для анализа определённых сегментов хромосом. Анализ хромосом требуется после генетического консультирования для пациентов, находящихся в группе риска генетического заболевания или при известном семейном заболевании. Для изоляции хромосом используются различные тканевые образцы: периферическая кровь, костный мозг, кожная биопсия или материалы аборта.
Анализ кариотипа:
Анализ кариотипа чаще всего выполняется на клетках, выделенных из периферической крови пациентов, хотя тип анализируемой ткани может варьироваться в зависимости от хромосомного заболевания или возраста пациента при постановке диагноза. Пациенты должны дать информированное согласие перед взятием образцов для анализа. Каждому типу ткани необходимы свои условия хранения и транспортировки в лабораторию, поэтому установлены критерии приёма и отклонения образцов. Время подготовки диагностического отчета после анализа хромосом может изменяться в зависимости от условий культуры образцов пациента.
Хромосомы не видны невооружённым глазом и наблюдаются только под микроскопом после окрашивания изолированных клеток. Они имеют яркие и тёмные горизонтальные полосы, пронумерованные от центромеры (точка соединения короткого и длинного плеча хромосомы) к противоположному концу. Этот вид анализа хромосом также называется анализом кариотипа. Если изменения в хромосомах достаточно велики, анализ кариотипа может выявить хромосомные аберрации (прибавление или потеря хромосомного материала) или перестройки.
Результаты цитогенетических и молекулярно-цитогенетических тестов могут быть сложными для интерпретации или иногда не отражать реальной ситуации у пациента. Численные или крупные структурные аномалии легче обнаружить этими методами, в то время как мелкие структурные аномалии и мозаицизм могут оставаться невыявленными. Эти тесты предназначены для специфических факторов риска и предоставляют информацию только о конкретном заболевании, не отражая другие возможные болезни. Кроме того, различные заболевания или аномалии генетического или иного происхождения могут наблюдаться даже у людей с нормальным кариотипом.
Полосное окрашивание хромосом используется для выявления перестроек хромосом размером 5–10 мб путем анализа структуры и числа хромосом в зависимости от различий в рисунке полос. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) является специфическим и чувствительным методом, позволяющим обнаруживать локализацию генов на хромосомах. Эта техника может выявлять хромосомные аномалии размером 1–3 мб, которые невозможно увидеть под световым микроскопом. Она также позволяет анализировать численные и/или структурные аномалии в ядре клеток без предварительной изоляции хромосом и может применяться при преимплантационной, пренатальной и постнатальной диагностике генетических заболеваний для исследования делеций, транслокаций и амплификаций генов.
FISH — метод молекулярной цитогенетики, широко используемый в цитогенетической диагностике, который включает анализ хромосом и ядра, изолированных из культивированных клеток после гибридизации с ДНК-зондами, меченными флуоресцентными красителями. Этот метод дает информацию только о тех участках хромосом, которые распознаются ДНК-зондами, и не выявляет аномалии в других участках той же или другой хромосомы.
aCGH (array Comparative Genomic Hybridization):
aCGH — новый метод, позволяющий детально исследовать геном (разрешение 25 кб). aCGH сравнивает ДНК пациента с ДНК здорового человека для выявления различий между образцами, что позволяет обнаружить нарушения числа копий (прибавление или потеря) в ДНК. Метод позволяет анализировать несбалансированные конститутивные перестройки в геноме и их влияние на гены. Нарушения числа копий — это мелкие изменения ДНК, которые не видны под микроскопом и называются «субмикроскопическими изменениями». Они могут влиять на рост, развитие и экспрессию генов, что способствует развитию различных заболеваний у взрослых.
Принцип работы aCGH:
Микромассивы состоят из тысяч ДНК-зондов, прикрепленных к стеклянной поверхности. ДНК пациента разрушается на небольшие фрагменты и мечется флуоресцентным красителем. ДНК здорового человека используется как референс и мечется другим красителем. Образцы ДНК пациента и референса смешиваются и наносятся на один слайд, где фрагменты гибридизуются с комплементарными зондами. Затем слайды сканируются микромассивным сканером, который измеряет флуоресцентные сигналы и выявляет делеций или дупликации в геноме пациента.
Молекулярно-генетические тесты:
Наследственность — информация, передаваемая потомству и влияющая на его характеристики. Универсальная характеристика живых организмов — хранение, использование и передача наследственной информации для выполнения жизненных функций. Нуклеиновые кислоты, строительные блоки клеток, отвечают за эти функции.
Нуклеиновые кислоты состоят из повторяющихся единиц — нуклеотидов, каждый из которых содержит: 1) азотистое основание, 2) пятиуглеродный сахар (пентозу) и 3) фосфатную группу. В клетке присутствуют два вида нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Они различаются типами азотистых оснований: аденин, гуанин и цитозин присутствуют в обеих, тимин только в ДНК, урацил только в РНК. У большинства организмов наследственная информация хранится в ДНК.
Научные достижения с момента открытия структуры ДНК Уотсоном и Криком в 1953 году показали поток наследственной информации в клетке и способствовали развитию методов молекулярной биологии для диагностики генетических заболеваний.
Ранее диагностика генетических заболеваний ограничивалась клинической оценкой и биохимическими тестами, основанными на анализе белков. Основная причина — необходимость найти правильную ткань, экспрессирующую белок для анализа. Присутствие ДНК во всех ядрах клеток и относительная простота её получения из периферической крови позволили использовать диагностические тесты, включая «прогностические» тесты, «пресимптоматическую